Reação em cadeia da polimerase

Uma tira de oito tubos de PCR, cada um contendo uma reacção de 100 uL.

A reacção em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica amplamente utilizada em Biologia molecular. Ele deriva seu nome de um dos seus principais componentes, um ADN-polimerase utilizada para amplificar uma parte de ADN pela in vitro enzimática replicação. Como progride PCR, o DNA gerado deste modo é em si utilizada como um modelo para a replicação. Isto põe em movimento uma reacção em cadeia na qual o molde de ADN é exponencialmente amplificado. A PCR é possível amplificar um único ou algumas cópias de um pedaço de ADN em várias ordens de grandeza, gerando milhões ou mais cópias da parte de ADN. A PCR pode ser extensivamente modificadas para executar uma vasta variedade de manipulações genéticas.

Quase todas as aplicações de PCR empregar uma polimerase de ADN estável ao calor, tal como Taq polimerase, uma enzima isolada originalmente a partir da bactéria Aquaticus de Thermus. Este DNA polimerase enzymatically monta uma nova fita de DNA a partir de blocos de construção de DNA, a nucleótidos, utilizando ADN de cadeia simples como molde e Oligonucleótidos de ADN (também chamados Iniciadores de ADN) necessária para a iniciação da síntese de ADN. A grande maioria dos métodos PCR uso ciclos térmicos, isto é, alternadamente aquecimento e arrefecimento da amostra de PCR para uma série de passos de temperatura definido. Estes passos de ciclos térmicos são necessárias para separar fisicamente os cordões (a temperaturas elevadas) em uma hélice dupla de ADN ( De fusão do ADN) utilizado como molde durante a síntese de ADN (a temperaturas inferiores), através da polimerase de ADN para amplificar selectivamente o ADN alvo. A selectividade de PCR resultante da utilização de iniciadores que sejam complementar a região do ADN alvo para amplificação sob condições específicas de ciclos térmicos.

Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis, a PCR é agora uma técnica comum e muitas vezes indispensável utilizado nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de aplicações. Estes incluem Clonagem de DNA para baseada em DNA sequenciamento, filogenia, ou análise funcional do genes; o diagnóstico de doenças hereditárias; a identificação de impressões digitais genéticas (usado em ciências forenses e testes de paternidade); e a detecção e diagnóstico de doenças infecciosas . Em 1993 Mullis ganhou o Prêmio Nobel de Química por seu trabalho em PCR.

Princípios e procedimento de PCR

Figura 1a: Um termociclador velho para PCR

Figura 1b: Um modelo mais antigo termociclador três temperatura para a PCR

A PCR é utilizado para amplificar regiões específicas de uma cadeia de ADN (ADN alvo). Este pode ser um único gene, uma parte de um gene, ou uma sequência de não codificação. A maioria dos métodos de PCR tipicamente amplificar fragmentos de ADN de até 10 quilo pares de bases (kb), embora algumas técnicas permitem a amplificação de fragmentos de até 40 kb de tamanho.

A PCR configuração básica requer vários componentes e reagentes. Estes componentes incluem:

• Molde de ADN que contém a região de ADN (alvo) a ser amplificado.
• Dois iniciadores, que são complementares para as regiões de ADN no 5 '(cinco prime) ou 3 '(três privilegiada) termina da região do DNA.
• A Polimerase de ADN, tal como Taq-polimerase ou outra polimerase de ADN com uma temperatura óptima de cerca de 70 ° C.
• Desoxinucleotídeos (dNTPs; também muito comumente e erroneamente chamados deoxinucleotidos trifosfato), os blocos de construção a partir do qual as polimerases de DNA sintetiza uma nova fita de DNA.
• Solução-tampão, fornecendo um ambiente químico adequado para uma actividade óptima e estabilidade da polimerase de ADN.
• Divalentes catiões , de magnésio ou de manganês iões; geralmente Mg ²⁺ é utilizado, mas Mn ²⁺ pode ser utilizado para a mutagénese de ADN mediada por PCR, como superior Mn ²⁺ concentração aumenta a taxa de erro durante a síntese de ADN
• Cação monovalentes potássio íons.

A PCR é geralmente realizada num volume de reacção de 10-200 ul em tubos de reacção pequenos (0,2-0,5 ml) em volumes de um termociclador. O aparelho de ciclos térmicos aquece e arrefece os tubos de reacção para alcançar as temperaturas desejadas em cada passo da reacção (ver abaixo). Muitos termocicladores modernos fazem uso do Efeito de Peltier, que permite tanto a aquecimento e arrefecimento do bloco segurando os tubos de PCR simplesmente invertendo a corrente eléctrica. Tubos de reacção de parede fina permitir condutividade térmica favorável para permitir o rápido equilíbrio térmico. A maioria dos termocicladores possuem tampas aquecidas para evitar a condensação na parte superior do tubo de reacção. Termocicladores mais velhos que faltam uma tampa aquecida requerem uma camada de óleo no topo da mistura de reacção ou uma esfera de cera no interior do tubo.

Procedimento

Figura 2: Desenho esquemático do ciclo de PCR (1) desnaturação a 94-96 ° C.. (2) recozimento a ~ 65 ° C (3) O alongamento a 72 ° C. Quatro ciclos são mostradas aqui. As linhas azuis representam o molde de ADN para a qual os iniciadores (setas vermelhas) recozimento que está estendido pela polimerase de ADN (círculos luz verde), para se obter produtos mais curtos de ADN linhas (verde), que são eles próprios utilizados como moldes de PCR como progride.

O PCR geralmente é constituído por uma série de 20 a 40 mudanças de temperatura repetidos ciclos de chamadas; cada ciclo consiste tipicamente de 2-3 passos discretos de temperatura. Mais comumente PCR é realizada com ciclos que têm três passos de temperatura (Fig. 2). O ciclo é frequentemente precedida por um único passo de temperatura (chamado preensão) a uma temperatura elevada (> 90 ° C), e seguido por uma espera na extremidade da extensão do produto final ou breve armazenamento. As temperaturas utilizadas e a duração do momento em que são aplicados em cada ciclo dependerá de uma variedade de parâmetros. Estes incluem a enzima utilizada para a síntese de ADN, a concentração de iões divalentes e dNTP na reacção, e a temperatura de fusão ( Tm) dos iniciadores.

• Etapa de inicialização: Esta etapa consiste em aquecer a reacção a uma temperatura de 94-96 ° C (ou 98 ° C, se polimerases termostáveis são extremamente utilizados), que é realizada por 1-9 minutos. Ele só é necessário para polimerases de DNA que requerem ativação de calor por hot-start PCR .

• Passo de desnaturação: Este passo é o primeiro acontecimento frequente ciclismo e consiste em aquecer a reacção a 94-98 ° C durante 20-30 segundos. Ela provoca derretimento do molde de DNA e primers por perturbar as ligações de hidrogênio entre as bases complementares das cadeias de DNA, produzindo cadeias simples de DNA.

• Passo de recozimento: A temperatura de reacção é reduzida para 50-65 ° C durante 20-40 segundos, permitindo que o recozimento dos iniciadores para o molde de ADN de cadeia simples. Tipicamente, a temperatura de recozimento é de cerca de 3-5 graus C abaixo da Tm dos iniciadores utilizados. Pontes de hidrogênio DNA-DNA estável são formados somente quando a sequência de iniciador corresponde muito de perto a sequência molde. A polimerase liga-se o híbrido iniciador-molde e inicia a síntese do ADN.

• Extensão / alongamento passo: A temperatura deste passo depende da ADN-polimerase utilizada; Polimerase Taq tem o seu óptimo temperatura de actividade a 75-80 ° C, e geralmente a uma temperatura de 72 ° C é usada com esta enzima. Neste passo, a ADN-polimerase sintetiza uma nova cadeia de ADN complementar da cadeia molde de ADN pela adição de dNTP que são complementares ao molde em 5 'para 3', 5'-condensação grupo fosfato dos dNTP com o 3'- grupo hidroxilo no fim da nascente (extensão) cadeia de ADN. O tempo de extensão depende quer da polimerase de ADN utilizada e do comprimento do fragmento de DNA a ser amplificado. Como uma regra de ouro-, em sua temperatura ótima, a DNA polimerase polimerizará mil bases por minuto. Em condições óptimas, isto é, se não houver limitações devido à limitação substratos ou reagentes, em cada passo de extensão, a quantidade de ADN alvo é duplicado, levando a exponencial (geométrico) a amplificação do fragmento de ADN específico.

• Alongamento final: Este passo é único, ocasionalmente, realizada a uma temperatura de 70-74 ° C durante 5-15 minutos, após o último ciclo de PCR para assegurar que todo o ADN de cadeia simples restante é totalmente estendido.

• Espera final: Este passo de 4-15 ° C, durante um tempo indefinido pode ser utilizado para armazenagem de curta duração da reacção.

Figura 3: produtos de etídio corado com brometo de PCR após electroforese em gel. Dois conjuntos de iniciadores foram utilizados para amplificar uma sequência alvo, a partir de três amostras de tecido diferentes. Sem amplificação está presente na amostra # 1; As bandas de DNA na amostra # 2 e # 3 indicam uma amplificação bem sucedida da sequência alvo. O gel também mostra um controlo positivo, e um segmento de ADN contendo os fragmentos de DNA de comprimento definido para dimensionar as bandas nas PCRs experimentais.

Para verificar se o produzido por PCR do fragmento de DNA esperado (também por vezes referido como o amplimero ou amplicão), electroforese em gel de agarose é utilizado para separação por tamanhos dos produtos de PCR. O tamanho (s) de produtos de PCR é determinada por comparação com uma escada de ADN (um marcador de peso molecular), que contém fragmentos de ADN de tamanho conhecido, correr no gel ao lado dos produtos de PCR (ver Fig. 3).

Etapas de PCR

O processo de PCR pode ser dividido em três fases:

Amplificação exponencial: Em cada ciclo, a quantidade de produto é dobrado (assumindo 100% de eficiência de reacção). A reacção é muito específico e preciso.

Nivelamento do palco: A reacção abranda à medida que a polimerase de ADN perde actividade e como o consumo de reagentes tais como os dNTP e iniciadores faz com que eles se tornem limitantes.

Plateau: Não mais produto se acumula devido ao esgotamento de reagentes e enzima.

Otimização PCR

Na prática, a PCR pode falhar por variadíssimas razões, em parte devido à sua sensibilidade à contaminação levando a amplificação de produtos de ADN espúrias. Devido a isso, uma série de técnicas e procedimentos foram desenvolvidos para optimizar as condições de PCR. A contaminação com DNA estranho é abordada com protocolos e procedimentos que separam misturas pré-PCR de potenciais contaminantes de DNA de laboratório. Isto envolve geralmente separação espacial das áreas PCR adicionais de áreas para análise ou purificação de produtos de PCR, e a limpeza completa da superfície de trabalho entre as configurações de reacção. Primer técnicas de concepção são importantes para melhorar o rendimento do produto de PCR e para evitar a formação de produtos espúrios, e o uso dos componentes do tampão alternativos ou enzimas polimerases podem ajudar com a amplificação de regiões longos ou de outra forma problemáticos de ADN.

Aplicação de PCR

Isolamento de ADN genómico

PCR permite o isolamento de fragmentos de ADN a partir de ADN genómico por amplificação selectiva de uma região específica de ADN. Este uso da PCR aumenta muitos métodos, tais como a geração sondas de hibridação para Southern ou hibridação norte e Clonagem de ADN, que requerem grandes quantidades de ADN, representando uma região específica de DNA. PCR fornece estas técnicas com quantidades elevadas de ADN puro, permitindo a análise de amostras de ADN a partir de mesmo pequenas quantidades de material de partida.

Outras aplicações de PCR incluem A sequenciação de ADN para determinar sequências amplificadas por PCR-desconhecidos em que um dos iniciadores de amplificação podem ser utilizados na sequenciação de Sanger, o isolamento de uma sequência de ADN para acelerar tecnologias de ADN recombinante que envolvem a inserção de uma sequência de ADN numa plasmídeo ou o material genético de um outro organismo. As colónias bacterianas ( E.coli) podem ser rapidamente rastreados por PCR para DNA correto construções de vector. De PCR pode também ser utilizada para impressão digital genética; forense uma técnica utilizada para identificar uma pessoa ou organismo comparando ADNs experimentais por meio de métodos baseados em PCR diferentes.

Métodos 'impressões digitais' Alguns PCR tem alta potência discriminativo e pode ser usado para identificar as relações genéticas entre os indivíduos, como entre pais e filhos ou entre irmãos, e são usados em testes de paternidade (Fig. 4). Esta técnica também pode ser usada para determinar as relações evolutivas entre os organismos.

Figura 4: Electroforese de fragmentos de DNA amplificados por PCR. (1) Pai. (2) Criança. (3) Mother. A criança herdou algumas, mas não todas as impressões digitais de cada um dos pais, dando-lhe uma nova, impressão digital única.

A amplificação e quantificação de ADN

Porque PCR amplifica as regiões de ADN que tem como alvo, o PCR pode ser utilizado para analisar quantidades muito pequenas de amostra. Este é frequentemente crítico para análise forense, quando apenas uma quantidade vestigial de ADN está disponível como prova. De PCR pode também ser utilizada na análise de ADN antigo que é milhares de anos. Estas técnicas à base de PCR foram usados com sucesso em animais, tal como um mil-quarenta anos de idade mamute , e também no DNA humano, em aplicações que vão desde a análise de egípcios múmias para a identificação de um Russo Tsar.

Métodos de PCR quantitativo permite a estimativa da quantidade de uma dada sequência presente em uma amostra - uma técnica frequentemente aplicado para determinar quantitativamente os níveis de a expressão do gene. PCR em tempo real é uma ferramenta estabelecida para quantificação de ADN que mede a acumulação do produto de ADN após cada ciclo de amplificação por PCR.

• Veja também O uso de DNA em entomologia forense

PCR no diagnóstico de doenças

PCR permite o diagnóstico precoce de doenças malignas, como leucemia e linfomas, que é atualmente o mais alto desenvolvido na pesquisa do câncer e já está sendo utilizada de forma rotineira. Os ensaios de PCR pode ser realizada directamente em amostras de ADN genómico para detectar células malignas específicas de translocação com uma sensibilidade que é de pelo menos 10.000 vezes mais elevada do que outros métodos.

PCR também permite a identificação de microrganismos não cultiváveis ou de crescimento lento, tais como micobactérias, bactérias anaeróbicas, ou vírus de ensaios de cultura de tecidos e em modelos animais. A base para aplicações de diagnóstico de PCR em microbiologia, é a detecção de agentes infecciosos e a discriminação de não patogénica a partir de estirpes patogénicas em virtude de genes específicos.

Viral DNA pode também ser detectado por PCR. Os iniciadores utilizados precisam de ser específico para as sequências específicas no ADN de um vírus, e a PCR pode ser utilizado para análises de diagnóstico ou sequenciação de ADN do genoma viral. A elevada sensibilidade da PCR permite a detecção de vírus logo após a infecção e mesmo antes do aparecimento da doença. Tal detecção precoce pode dar aos médicos uma vantagem significativa no tratamento. A quantidade de vírus ("carga viral") em um paciente também pode ser quantificada por meio de técnicas de quantificação de ADN baseadas em PCR (ver abaixo).

Variações sobre a técnica básica de PCR

• PCR específica do alelo: Esta técnica de diagnóstico ou de clonagem é utilizada para identificar ou utilizar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) (diferenças de uma única base no DNA). Ele requer um conhecimento prévio de uma sequência de ADN, incluindo as diferenças entre alelos, e utiliza primers cujas extremidades 3 'abranger o SNP. A amplificação por PCR sob condições rigorosas é muito menos eficiente, na presença de uma incompatibilidade entre modelo e iniciador, de modo a amplificação bem sucedida com uma presença de sinais de iniciadores específicos do SNP do SNP numa sequência específica. Ver SNP genotipagem para mais informações.

• Assembléia PCR ou Assembleia Ciclismo Polimerase (PCA): Montagem de PCR é a síntese artificial de longas sequências de DNA através da realização de PCR com um conjunto de oligonucleótidos com longos segmentos curtos sobrepostos. Os oligonucleótidos alternados entre sentido e anti-sentido, instruções e os segmentos sobrepostos determinar a ordem dos fragmentos de PCR, assim, produzir selectivamente o produto final de ADN de comprimento.

• PCR assimétrico: PCR assimétrico é usado para amplificar preferencialmente um fio do original de DNA mais do que o outro. Ele encontra utilização em alguns tipos de sequenciação e hibridação sondagem onde tendo apenas um dos dois suportes complementares é necessário. A PCR é realizada, como de costume, mas com um grande excesso de um dos iniciadores para o fio escolhido. Devido à lenta ( aritmética ) amplificação mais tarde na reacção após o iniciador limitante se esgotar, são necessários ciclos adicionais de PCR. Uma modificação recente sobre esse processo, conhecido como L inear- Um fter- t ele- E xponential-PCR (por LATE-PCR), utiliza um iniciador limitante com uma temperatura de fusão mais elevado ( Temperatura de fusão | Tm) do que o iniciador em excesso para manter a eficiência de reacção como a concentração do iniciador limitante diminui meados de reacção.

• Amplificação dependente de helicase: Esta técnica é semelhante a PCR tradicional, mas utiliza uma temperatura constante, em vez de ciclo através ciclos de desnaturação e recozimento / extensão. ADN Helicase, uma enzima que se desenrola de ADN, é utilizado em lugar da desnaturação térmica.

• PCR de arranque a quente: Esta é uma técnica que reduz a amplificação não específica durante a configuração inicial etapas do PCR. A técnica pode ser realizada manualmente por aquecimento dos componentes da reacção para a temperatura de fusão (por exemplo, 95 ° C) antes da adição da polimerase. Sistemas de enzimas especializadas têm sido desenvolvidos que inibem a actividade da polimerase a temperatura ambiente, quer através da ligação de um anticorpo ou pela presença de inibidores da ligação covalente que só se dissociam após uma etapa de activação de alta temperatura. Hot-start / frio-finish PCR é conseguido com polimerases novos híbridos que estão inativas à temperatura ambiente e são imediatamente activadas à temperatura de alongamento.

• Intersequence-específico (ISSR) PCR: um método de PCR para identificação de DNA que amplifica as regiões entre alguns simples seqüência repete para produzir uma impressão digital única de comprimentos de fragmentos amplificados.

• PCR inverso: um método de PCR utilizado para permitir que quando apenas uma sequência interna é conhecido. Isto é especialmente útil na identificação de sequências que flanqueiam a várias inserções genómicas. Isto envolve uma série de As digestões de DNA e auto-ligação, o que resulta em sequências conhecidas em ambas as extremidades da sequência desconhecida.

• PCR mediada por ligação: Este método utiliza pequenos ligantes de ADN ligadas ao ADN de interesse e vários iniciadores de recozimento para os ligantes de ADN; ela tem sido usada para sequenciamento de DNA, o genoma curta, e Footprinting ADN.

• Metilação específicas de PCR (MSP): O método de MSP foi desenvolvido por Stephen e Baylin Jim Herman no Hopkins School of Medicine Johns, e é utilizado para detectar a metilação de ilhas CpG no ADN genómico. ADN é primeiro tratado com bissulfito de sódio, bases de citosina, que converte não metiladas em uracilo, o qual é reconhecido por iniciadores de PCR como timina. Duas reacções de PCR são então realizadas sobre o ADN modificado, utilizando o iniciador conjuntos idênticos excepto em quaisquer ilhas de CpG dentro das sequências de iniciadores. Nesses pontos, um conjunto de primers reconhece DNA com cytosines para amplificar DNA metilado, e um conjunto reconhece ADN com uracilo ou timina para amplificar DNA não metilado. MSP usando qPCR também pode ser realizado para obter informação quantitativa do que qualitativa sobre metilação.

• @ Minipimer @ PCR: @ minipimer @ PCR utiliza uma polimerase termoestável romance (S-Tbr) que pode estender-se a partir de iniciadores curtos ("smalligos") tão curto quanto 9 ou 10 nucleótidos, em vez de os cerca de 20 nucleótidos exigidos pela Taq. Este método permite a PCR para regiões de ligação do iniciador menor, e é particularmente útil para amplificar desconhecido, mas conservada, sequências de DNA, tais como as (16S ou 18S rRNA gene eucarióticas). 16S rRNA @ minipimer @ PCR foi utilizado para caracterizar uma comunidade de tapete microbiano crescendo em um ambiente extremo, uma lagoa hypersaline em Puerto Rico. Nesse estudo, profundamente sequências divergentes foram descobertos com alta freqüência e que incluía representantes definidos dois novos taxa de nível de divisão, sugerindo que a PCR @ minipimer @ pode revelar novas dimensões da diversidade microbiana. Ao alargar o "espaço de sequência" que podem ser consultados pelos iniciadores de PCR, esta técnica pode permitir que novas estratégias de PCR que não são possíveis dentro dos limites do desenho de primers impostas pela Taq e outras enzimas vulgarmente utilizadas.

• Multiplex dependente de ligadura sonda de amplificação (MLPA): permite que vários alvos a ser amplificada com apenas um único par de iniciadores, evitando assim as limitações de resolução de PCR multiplex (ver abaixo).

• Multiplex-PCR: O uso de múltiplos conjuntos de iniciadores únicos dentro de uma única mistura de PCR para produzir amplicões de diferentes tamanhos específicos para sequências de ADN diferentes. Ao direcionar vários genes de uma só vez, informações adicionais podem ser adquirida a partir de um único teste que de outro modo exigiria várias vezes os reagentes e mais tempo para executar. As temperaturas de recozimento para cada um dos conjuntos de iniciadores deve ser optimizado para funcionar correctamente dentro de uma única reacção, e tamanhos amplicon, ou seja, o seu comprimento de pares de bases, deverá ser suficientemente diferentes de modo a formar bandas distintas quando visualizado por electroforese em gel.

• Nested PCR: aumenta a especificidade da amplificação de ADN, através da redução de fundo devido à amplificação não específica de ADN. Dois conjuntos de iniciadores estão a ser utilizados em duas reacções de PCR sucessivas. Na primeira reacção, um par de iniciadores é usado para gerar produtos de ADN, que além do alvo pretendido, ainda podem consistir em fragmentos de DNA amplificados de forma não específica. O produto (s) são então usados numa segunda PCR com um conjunto de iniciadores cujos locais de ligação são parcialmente ou completamente diferentes dos e localizado a 3 'de cada um dos iniciadores utilizados na primeira reacção. Nested PCR é muitas vezes bem sucedida em mais especificamente amplificar fragmentos longos de ADN de PCR convencional, mas requer um conhecimento mais profundo das sequências alvo.

• PCR overlap-extension: é um técnica de engenharia genética, permitindo a construção de uma sequência de ADN com uma alteração inserido para além do limite do comprimento do iniciador mais longo prático.

• PCR quantitativa (Q-PCR): é utilizado para medir a quantidade de um produto de PCR (de um modo preferido em tempo real). É o método de escolha para medir quantitativamente quantidades de partida de ADN, ADNc ou ARN. Q-PCR é utilizada para determinar se uma sequência de ADN que está presente numa amostra e o número das suas cópias na amostra. O método actualmente com o mais alto nível de exactidão é-PCR quantitativo em tempo real. Ele é muitas vezes conhecido como confusa RT-PCR (R eal t ime PCR) ou RQ-PCR. QRT-PCR ou RTQ-PCR são contrações mais adequadas. RT-PCR geralmente se refere a transcrição reversa PCR (ver abaixo), que é muitas vezes usado em conjunto com Q-PCR. Métodos de QRT-PCR utilizar corantes fluorescentes, tais como SYBR Green, ou As sondas de ADN contendo fluoróforos, tais como a TaqMan, para medir a quantidade de produto amplificado em tempo real.

• RT-PCR: (R everse t ranscription PCR) é um método utilizado para amplificar, isolar ou identificar uma sequência conhecida de um celular ou tecido ARN. A PCR é precedida por uma reacção usando transcriptase reversa para converter ARN de ADNc. RT-PCR é amplamente usado em perfil de expressão, para determinar a expressão de um gene ou para identificar a sequência de um transcrito de ARN, incluindo o início da transcrição e locais de terminação e, se a sequência de ADN genómico de um gene é conhecida, para mapear a localização de exons e intrões no gene. A extremidade 5 'de um gene (que corresponde ao sítio de iniciação da transcrição) é normalmente identificado por um método de RT-PCR, com o nome RACE-PCR, abreviação de Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA.

• Sólido PCR Fase: engloba múltiplos significados, incluindo Polony Amplificação (PCR, onde as colónias são derivados numa matriz de gel, por exemplo), 'ponte de PCR "(apenas os iniciadores presentes estão covalentemente ligados à superfície de suporte sólido), em fase sólida convencional de PCR (PCR assimétrico onde é aplicada na presença de sólido iniciador com a sequência de suporte de chumaceira correspondentes, um dos iniciadores aquosas) e reforçada em Fase Sólida de PCR (em que fase sólida convencional de PCR pode ser melhorada empregando alta Tm iniciador suporte sólido com a aplicação de um "passo" térmico para favorecer suporte sólido priming).

• CAUDA-PCR: PCR assimétrica entrelaçado térmica é utilizada para isolar sequências desconhecidas que flanqueiam uma sequência conhecida. Dentro da sequência conhecida TAIL-PCR utiliza um par de primers nested com diferentes temperaturas de recozimento; um iniciador degenerado é utilizada para amplificar na outra direcção a partir da sequência desconhecida.

• Touchdown PCR: uma variante da PCR, que visa reduzir o fundo não específica através da progressiva diminuição da temperatura de recozimento como PCR ciclismo progride. A temperatura de emparelhamento para os ciclos iniciais é geralmente alguns graus (3-5C) acima da _Tm dos iniciadores utilizados, enquanto nos ciclos posteriores, é poucos graus (3-5C) abaixo do iniciador t _m. As temperaturas mais altas dão uma maior especificidade de ligação do iniciador, e as temperaturas mais baixas permitem a amplificação mais eficiente dos produtos específicos formados durante os ciclos iniciais.

• PAN-AC: Este método utiliza condições isotérmicas para a amplificação, e pode ser utilizado em células vivas.

• Andar rápido Universal: este método permite genoma curta e impressão digital genética usando um mais específico 'dois lados' PCR do que as abordagens convencionais "unilateral" (usando apenas um primer específico para o gene e um iniciador geral - o que pode levar a "ruído artefactual ») por força de um mecanismo que envolve a formação da estrutura lariat. Derivados simplificados de UFW são RAGE Lane (PCR nested para amplificação rápida de DNA genômico dependente do laço termina), 5'RACE Lane e 3'RACE Lane.

História

Uma 1971 papel na Journal of Molecular Biology por Kleppe e colaboradores descrito pela primeira vez um método usando um ensaio enzimático para replicar um molde de ADN com iniciadores curta in vitro. No entanto, esta manifestação precoce do princípio básico PCR não recebeu muita atenção, ea invenção da reacção em cadeia da polimerase em 1983 é geralmente creditado a Kary Mullis.

No núcleo do método de PCR é a utilização de um adequado ADN-polimerase capaz de suportar as altas temperaturas de> 90 ° C (> 195 ° F) necessários para a separação das duas cadeias de ADN na DNA de dupla hélice após cada ciclo de replicação. As polimerases de ADN inicialmente empregue para experimentos in vitro pressagiando PCR não foram capazes de resistir a essas temperaturas elevadas. Assim, os primeiros processos de replicação de ADN eram bastante ineficiente, consome tempo, e necessárias grandes quantidades de ADN polimerase e tratamento contínuo durante todo o processo.

Uma descoberta de 1976 Taq polimerase uma polimerase de ADN purificado a partir da bactéria termófila, Aquaticus de Thermus, que ocorre naturalmente em quente (50 a 80 ° C (120-175 ° F)) ambientes pavimentou o caminho para melhorias dramáticas do método de PCR. A polimerase de ADN isolada a partir de T. aquaticus é estável a temperaturas elevadas que estão activas, mesmo após desnaturação do ADN, obviando assim a necessidade de adicionar nova polimerase de ADN após cada ciclo. Isto permitiu que um processo baseado em termociclador automático para amplificação de ADN.

Na época, ele desenvolveu PCR em 1983, Mullis estava trabalhando em Emeryville, Califórnia, para Cetus Corporation, uma das primeiras biotecnologia empresas. Lá, ele foi responsável pela síntese de cadeias curtas de DNA. Mullis escreveu que ele concebeu PCR ao cruzar ao longo da Pacific Coast Highway uma noite em seu carro. Ele estava jogando em sua mente com uma nova maneira de analisar mudanças (mutações) no DNA quando ele percebeu que ele tinha em vez inventou um método de amplificar qualquer região do DNA através de ciclos repetidos de duplicação impulsionado pela DNA polimerase.

Em Scientific American, Mullis resumido o procedimento: "A partir de uma única molécula do material genético do ADN, a PCR pode gerar 100 mil milhões de moléculas semelhantes em uma tarde A reacção é de fácil execução Não requer mais do que um tubo de ensaio, alguns.. reagentes simples, e uma fonte de calor ". Ele foi agraciado com o Prêmio Nobel de Química em 1993 por sua invenção, sete anos depois que ele e seus colegas da Cetus primeiro colocou a proposta em prática. No entanto, algumas polêmicas permaneceram sobre as contribuições intelectuais e práticas de outros cientistas a trabalhar em Mullis ', e se ele tivesse sido o único inventor do princípio PCR. (Ver artigo principal: Kary Mullis)

Guerras de patentes

A técnica de PCR foi patenteado pela Cetus Corporation, onde trabalhou Mullis quando inventou a técnica em 1983. A Taq enzima polimerase também foi coberto por patentes. Houve várias ações judiciais de alto nível relacionados à técnica, incluindo um processo judicial interposto por vencida DuPont. A empresa farmacêutica Hoffmann-La Roche adquiriu os direitos sobre as patentes em 1992 e atualmente ocupa aqueles que ainda estão protegidos.

A batalha de patentes relacionadas sobre a enzima polimerase Taq ainda está em curso em várias jurisdições ao redor do mundo entre Roche e Promega. Os argumentos jurídicos estenderam além da vida das patentes originais polimerase PCR e Taq, que expirou em 28 de março de 2005